Citometrie în flux - natură și aplicații

Citofluorimetria în flux este o metodă citologică metoda de cercetare, utilizate pentru analiza aprofundată a celulelor. Avantajul său este că permite studierea fiecărei celule în parte. Acest tip de analiză ajută la evaluarea mai multor parametri în sute de celule în câteva secunde. Acest lucru face ca citofluorimetria în flux să fie una dintre cele mai rapide și mai precise metode de analiză disponibile în prezent pentru oamenii de știință și clinicieni.

Principiul

Principiul metodei de citofluorimetrie în flux se bazează pe măsurarea dispersiei luminii și a luminescenței (fluorescenței) celulelor. Suspensia de celule este trecută ca un flux la viteză mare printr-o celulă de citometru, unde este iradiată cu un laser. În acest caz, se realizează așa-numita focalizare hidrodinamică. Mecanismul său constă în faptul că fluxul din celula cu particulele studiate la ieșire se scurge într-un jet extern, care are o viteză mai mare. Rezultatul este o aliniere a particulelor într-o secvență ordonată.

Celulele sunt marcate preliminar cu coloranți fluorescenți speciali (fluorocromi). Acestea permit fasciculului laser să exciteze o luminescență secundară. Semnalele luminoase recepționate sunt înregistrate de detectoare. Informațiile sunt apoi prelucrate cu ajutorul unor algoritmi software care permit numărarea populațiilor de celule individuale care diferă în funcție de anumite criterii.

Examinarea cu ajutorul microscopiei convenționale nu permite adesea să se facă distincția între diferitele celule, deoarece toate arată la fel. Citofluorimetria poate furniza alte date (integritatea structurii ADN-ului), analiza expresiei proteinelor, supraviețuirea celulelor.

Deoarece fluorocromii necesită diferite lungimi de undă ale luminii și diferite tipuri de detectoare, instalațiile moderne sunt echipate cu mai multe canale de detecție (de la 4 la 30). Numărul de emițători laser poate fi cuprins între 1 și 7. Dispozitivele mai sofisticate permit studii multiparametrice ale mai multor proprietăți ale particulelor în același timp.

Avantaje și dezavantaje

Avantajele citofluorimetriei în flux includ următoarele:

• viteză mare de procesare (înregistrarea a până la 30.000 de evenimente în 1 secundă);
• posibilitatea de a analiza un număr mare de celule (până la 100 mln. în eșantion);
• Cuantificarea intensității fluorescenței;
• analiza fiecărei celule;
• investigarea simultană a unor procese eterogene;
• separarea automată a datelor privind populația celulară;
• o bună vizualizare a rezultatelor.

O altă caracteristică a acestei tehnologii este că particulele analizate pot fi colorate cu mai multe soluții fluorescente. Acest lucru permite efectuarea de studii multiparametrice.

Dezavantajele sunt echipamentul tehnic complicat și necesitatea unei pregătiri speciale a probelor.

Citometre

Primele dispozitive de acest tip au fost produse încă din 1968 în Germania, dar au fost răspândite mult mai târziu. În prezent, toate instrumentele de citometrie în flux pot fi subdivizate în 2 tipuri

• Dispozitive care măsoară lumina fluorescentă (două sau mai multe lungimi de undă), lumina care se împrăștie la un unghi de 10 și 90° (detector cu unghi mic și detector de împrăștiere laterală);
• dispozitive care, pe lângă măsurarea mai multor parametri celulare, sortează automat în grupuri în funcție de aceste criterii.

Detectorul de împrăștiere directă a luminii detectează dimensiunea celulei, în timp ce dispozitivul de împrăștiere laterală oferă informații privind prezența granulelor intracelulare, raportul volumic dintre citoplasmă și nucleu.

Citometrele clasice, spre deosebire de microscoapele optice, nu permit obținerea de imagini ale celulei. Cu toate acestea, în ultimii ani, au fost dezvoltate dispozitive combinate care sunt capabile să combine capacitățile unui microscop și ale unui citofluorimetru. Acestea vor fi discutate mai jos.

Vizualizarea citometrelor

O particularitate caracterizează instrumentele utilizate în citometria de flux clasică: dacă se detectează evenimente rare în populația de celule analizate, nu există posibilitatea de a evalua semnificația lor. Aceste particule se pot dovedi a fi fie rămășițele unor celule moarte, fie un grup rar de. În aparatele convenționale, astfel de date sunt excluse din fluxul total de evenimente, dar ele pot avea o valoare deosebită pentru analiza științifică și clinică.

Noua generație de citometre de flux cu vizualizare permite capturarea unei imagini a fiecărei celule care trece prin zona de detectare în flux. Este ușor de văzut făcând clic pe zona corespunzătoare a graficului, care este afișată pe monitorul computerului.

Domenii de aplicare

Citofluorimetrie în flux - metoda universală, care este utilizat în multe domenii ale medicinei și științei:

• imunologie;
• oncologie;
• transplantologie (transplant de măduvă roșie, transplant de celule stem);
• hematologie;
• toxicologie;
• Biochimie (măsurarea acidității în interiorul celulei, studiul altor parametri);
• farmacologie (crearea de noi medicamente);
• microbiologie;
• Parazitologie și virusologie;
• Oceanologie (studiul fitoplanctonului pentru a evalua starea corpurilor de apă și alte sarcini);
• Nanotehnologie și analiza microparticulelor.

Imunologie

Sistemul imunitar uman este alcătuit dintr-o mare varietate de celule. Citometria de flux în imunologie permite evaluarea structurii și funcției acestora, adică analiza morfofuncțională.

Astfel de studii au ajutat la explorarea naturii complexe a imunității. Fenotipurile celulare se modifică datorită activării cu antigeni, dezvoltării unor patologii și altor factori. Citofluorimetria poate separa subpopulațiile de celule imune într-un amestec complex și poate evalua toate modificările celulare în timp.

Oncologie

Una dintre cele mai importante sarcini în oncologie este diferențierea tipului de celule. Principiul analizei citometrice în flux oncohematologic se bazează pe următorul fenomen: atunci când proba este tratată cu un colorant fluorescent special, acesta se leagă de proteinele citoplasmatice. După diviziunea celulară, celulele care proliferează activ prezintă o scădere de două ori a conținutului său. În consecință, intensitatea luminescenței celulelor este redusă la jumătate.

Există și alte modalități de detectare a celulelor proliferante

• Utilizarea coloranților care se leagă de ADN (iodura de propidiu);
• aplicarea de uracil marcat;
• înregistrarea unor niveluri crescute de expresie a proteinelor cicline, care sunt implicate în reglarea ciclului celular.