Cromatografia de afinitate în medicină: caracteristici și aplicații

cromatografia este o metodă de separare a substanțelor. Se utilizează pentru analiza calitativă și cantitativă ulterioară a proprietăților fizice și chimice ale microparticulelor. O variantă a acestei tehnici este cromatografia de afinitate. Ideea de a diferenția compușii proteici folosind proprietatea de afinitate a moleculelor este cunoscută în știință de zeci de ani. Cu toate acestea, s-a dezvoltat doar în ultimii ani, după ce au fost introduse și utilizate ca matrice materiale hidrofile foarte poroase. Această metodă permite atât sarcini analitice (separarea și identificarea substanțelor), cât și sarcini pregătitoare (purificare, concentrare).

Esența

Cromatografia de afinitate (de la cuvântul latin affinis, "adiacent", "înrudit") se bazează pe interacțiuni afine, care reprezintă formarea de legături foarte specifice între o moleculă separatoare (ligand sau afinant) și molecula țintă. Aceste mecanisme sunt comune în natură (legarea mediatorilor sau a hormonilor și a receptorilor, a anticorpilor și a antigenelor, hibridizarea polinucleotidelor și alte tipuri de procese). Cromatografia de afinitate este practicată în medicină încă din 1951.

Separarea componentelor are loc după cum urmează:

• Soluția de lucru care conține substanța care urmează să fie izolată este trecută prin sorbent;
• Ligand depus pe matricea sorbentului, care reține substanța;
• concentrația (acumularea) substanței;
• Îndepărtarea substanței extrase de pe absorbant prin spălare cu un solvent.

Această metodă face posibilă izolarea celulelor întregi. O diferență față de cromatografia de sorbție convențională constă în faptul că există o puternică legare biospecifică a componentei izolate la sorbent, caracterizată printr-o selectivitate ridicată.

Adsorbanți

Următoarele substanțe sunt utilizate ca adsorbanți:

• Formulări de gel pe bază de agaroză, o polizaharidă derivată din agar. Cele mai utilizate trei tipuri de calitate sunt Sepharose 4B, CL (agaroză reticulată) și affi- gel. Acesta din urmă este un gel modificat de agaroză și poliacrilamidă. Este mai inert din punct de vedere biologic, stabil din punct de vedere chimic și termic.
• Gel de siliciu.
• Sticlă.
• Polimeri organici.

Se utilizează substanțe suplimentare pentru a elimina barierele mecanice din calea contactului cu ligandul, separându-l de suport (peptide, diamine, poliamine, oligozaharide).

Aparatul

Sunt disponibile următoarele componente de bază ale unui sistem de cromatografie de afinitate

• rezervoare de stocare a fazei mobile (eluent)
• pompe de înaltă presiune echipamente pentru hrănire media (cel mai adesea de tip piston);
• un filtru pentru curățarea eluenților de praf;
• Un dispozitiv de dozare;
• coloană cromatografică pentru separarea amestecului;
• un detector pentru a detecta componentele separate care ies din coloană;
• un înregistrator de cromatograme și o unitate cu microprocesor (calculator).

În prealabil, prin faza mobilă se trece heliu pentru a reduce cantitatea de aer dizolvat. Pot fi instalate mai multe pompe, controlate de un programator, pentru a varia concentrația eluentului. Coloanele cromatografice pot fi fabricate din oțel inoxidabil (în cazul în care se impun cerințe mai mari în ceea ce privește rezistența la coroziune), sticlă (universală) sau acrilic. Acestea pot avea un diametru de la 2 cm la 70 cm în scopuri pregătitoare. Micro coloane Ø10-150 µm sunt utilizate în cromatografia analitică.

Pentru a crește sensibilitatea detectoarelor, în amestec se adaugă reactivi care produc substanțe care absorb mai multă lumină în regiunea ultravioletă sau vizibilă a spectrului.

Metodologie

Se face o distincție între două tipuri de bază de cromatografie de afinitate lichidă:

• coloană, în care o coloană este umplută cu fază staționară și amestecul este trecut prin ea cu un curent de eluent. Separarea poate avea loc sub presiune sau prin gravitație.
• Strat subțire. Eluentul se deplasează pe un strat plat de adsorbant sub acțiunea forțelor capilare. Adsorbantul se aplică pe o placă de sticlă, ceramică sau tijă de cuarț, pe o folie metalică.

De bază etape de lucru includ:

• Pregătirea adsorbantului, fixarea ligandului pe suport;
• Introducerea unui amestec pentru separare într-o coloană cromatografică;
• încărcarea fazei mobile, legarea ligandului componentei;
• Înlocuirea fazei pentru separarea substanței legate.

Scop

Cromatografia de afinitate este utilizată pentru a izola următoarele tipuri de substanțe (tipul de ligand utilizat este indicat în paranteze):

• analogi ai inhibitorilor enzimatici, ai substraturilor și ai cofactorilor (enzime);
• Substanțe bio-organice cu proprietăți genetice străine, viruși și celule (anticorpi)
• Carbohidrați cu greutate moleculară mare, polimeri de monosacaride, glicoproteine (lectine);
• proteine nucleare, nucleotidiltransferaze (acizi nucleici);
• receptori, proteine de transport (vitamine, hormoni);
• Proteine care interacționează cu membranele celulare (celule).

Această tehnologie este utilizată și pentru a produce enzime imobilizate, iar legarea lor de celuloză permite producerea de imunosorbenți.

Cromatografia proteinelor de legare a ADN

Proteinele de legare a ADN-ului sunt izolate cu heparină. Acest glicozaminoglican este capabil să lege o gamă largă de molecule. Cromatografia de afinitate a proteinelor din această grupă este utilizată pentru a izola substanțe cum ar fi

• Factori de inițiere și de alungire a traducerii (sinteza moleculelor de acid nucleic și a proteinelor);
• Restrictaze (enzime care recunosc secvențe specifice în ADN bicatenar);
• ADN ligaze și polimeraze ADN (enzime care catalizează unirea a două molecule pentru a forma o nouă legătură chimică și care sunt implicate în replicarea ADN);
• inhibitori de serin protează, care joacă un rol important în procesele imunitare și inflamatorii
• factori de creștere: fibroblast, Schwann, endotelial;
• proteine ale matricei intercelulare;
• receptorii hormonali;
• lipoproteine.

Avantaje

Această metodă este una dintre cele mai specifice pentru izolarea compușilor reactivi (enzime și agregate mai mari - viruși). Cu toate acestea, nu este utilizat numai pentru separarea substanțelor biologic active.

Detectarea anticorpilor în cantități mici, cuantificarea acidului poliadenilic, determinarea expresă a greutăților moleculare ale dehidrogenazelor, eliminarea anumitor contaminanți, studiul cineticii de activare a formei inactive a tripsinei, structura moleculară a interferonilor umani - aceasta nu este lista completă a studiilor, în care Se utilizează cromatografia de afinitate. Utilizarea lor în clinică se datorează avantajelor lor, cum ar fi

• Capacitatea de a purifica eficient proteinele, polizaharidele, acizii nucleici. Acestea diferă ușor în ceea ce privește proprietățile lor fizico-chimice și sunt inactivate prin hidroliză, denaturare și alte efecte utilizate în alte metode.
• Separarea rapidă a substanțelor, natura dinamică a procesului.
• Nu este necesară purificarea specială a enzimelor sau omogenizarea izoenzimelor pentru determinarea constantelor de disociere.
• Capacitatea de a separa o gamă largă de substanțe.
• Consum redus de liganzi.
• Posibilitatea de separare a substanțelor în volume mari.
• Procesul reversibil de legare a macromoleculelor biologice.

Tehnica poate fi combinată cu altele și se pot aplica câmpuri suplimentare (gravitaționale, electromagnetice). Acest lucru sporește posibilitățile tehnice ale cromatografiei.

Ingineria enzimelor

O nouă ramură a biotehnologiei, ingineria enzimatică, a fost dezvoltată în mod activ datorită acestei metode.

Cromatografia de afinitate prezintă următoarele avantaje pentru izolarea enzimelor:

• Producerea de enzime în cantități mari și în timpi mai mici, ceea ce duce la reducerea costurilor;
• Imobilizarea enzimelor lărgește considerabil gama de aplicații ale acestora în medicină și industrie;
• Legarea enzimelor la un substrat solid insolubil oferă o oportunitate de a studia influența micro-mediului și direcția reacțiilor, care joacă un rol important în procesele naturale și fiziologice.